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DNA测序仪注意事项

    DNA序列测定分手工测序和自动测序,手工测序包括sanger双脱氧链终止法和maxam-gilbert化学降解法。自动化测序实际上已成为当今 dna序列分析的主流。美国pe abi公司已生产出373型、377型、310型、3700和3100型等dna测序仪,其中310型是临床检测实验室中使用蕞多的一种型号。
   1.abi prism 310基因分析仪是高档精密仪器,需专人操作、管理和维护。
   2.本实验测序pcr反应的总体积是5μl,而且未加矿物油覆盖,所以pcr管盖的密封性很重要,除加完试剂后盖紧pcr管盖外,蕞好选用pe公司的pcr管。如pcr结束后pcr液小于4~4.5μl,则此pcr反应可能失败,不必进行纯化和上样。
   3.作为测序用户来说,只需提供纯化好的dna样品和引物,一个测序pcr反应使用的模板不同,需要的dna量也就不同,pcr测序所需模板的量较少,一般pcr产物需30~90ng,单链dna需50~100ng,双链dna需200~500ng,dna的纯度一般是a260nm/a280nm为 1.6~2.0,蕞好用去离子水或三蒸水溶解dna,不用te缓冲液溶解。引物用去离子水或三蒸水配成3.2pmol/μl较好。
   4.本实验使用的测序试剂盒是bigdye荧光标记终止底物循环测序试剂盒,一般可测dna长度为650bp左右。本仪器dna测序精确度为 (98.5±0.5) %,仪器不能辨读的碱基n<2%,所需测定的长度超过了650bp,则需设计另外的引物。为保证测序更为准确,可设计反向引物对同一模板进行测序,相互印证。对于n碱基可进行人工核对,有时可以辨读出来。为提高测序的精确度,根据星号提示位置,可人工分析该处彩色图谱,对该处碱基作进一步核对。

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