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PCR仪的改进与完善

 
      Mullis*初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段,其缺点是:
  ①Klenow酶不耐高温, 90℃会变性失活,每次循环都要重新加。
  ②引物链延
  伸反应在37℃下进行,容易发生模板和引物之间的碱基错配,其PCR仪产物特异性较差,合成的DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化的PCR仪技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点,但由于Klenow酶不耐热,在DNA模板进行热变性时,会导致此酶钝化,每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期,给PCR仪技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。
  1988年初,Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR,其扩增的DNA片段很均一,真实性也较高,只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次,仍需加入新酶。
  1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌thermus aquaticus 中提取到一种耐热DNA聚合酶。 此酶具有以下特点:①耐高温,在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90%,在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%,在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%。②在热变性时不会被钝化,不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率,增加了扩增长度2.0Kb。由于提高了扩增的特异性和效率,因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别,将此酶命名为Taq DNA多聚酶Taq DNA Polymerase。此酶的发现使PCR广泛的被应用。

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