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测序仪进行pcr测序反应的操作步骤

   测序仪进行pcr测序反应的操作步骤:
  (1) 取0.2ml的pcr管,用记号笔编号,将管插在颗粒冰中,按下表加试剂:
  所加试剂 测定模板管 标准对照管
  bigdye mix 1μl 1μl
  待测的质粒dna 1μl -
  pgem-3zf (+) 双链dna - 1μl
  待测dna的正向引物 1μl -
  m13(-21)引物 - 1μl
  灭菌去离子水 2μl 2μl
  总反应体积5μl,不加轻矿物油或石蜡油,盖紧pcr管,用手指弹管混匀,稍离心。
  (2) 将pcr管置于9600或2400型pcr仪上进行扩增。98℃变性2min后进行pcr循环,pcr循环参数为96℃ 10s,50℃ 5s,60℃4min,25个循环,扩增结束后设置4℃保温。
  (3) 醋酸钠/乙醇法纯化pcr产物
  (4) 电泳前测序pcr产物的处理
  (5) 分析或打印出彩色测序图谱
  (6) 序列分析:仪器将自动进行序列分析,并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知,可通过序列比较以星号标出差异碱基处,提高工作效率



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